MICROORGANISMOS ASOCIADOS A LA MUERTE DESCENDENTE DEL MARAÑÓN[1]
Rito Herrera[2]; José Luis Causadías[3]; Melvin Jaén[4]; Carmen Bieberach[5];
Sandra Sopalda[6]; Zanya Aguilar[7]
RESUMEN
En
Panamá, el marañón (Anacardium
occidentale L.) se desarrolla principalmente en las tierras bajas de la
vertiente del Océano Pacífico. Las cifras del Instituto de Estadística
(Gobierno de Panamá) señalan la existencia de 963 253 plantas distribuidas en
406 ha comerciales y huertos de traspatio. El objetivo de esta investigación fue la
identificación de los principales agentes microbianos asociados a la llamada
“muerte descendente del marañón”, entre cuyos síntomas se pueden mencionar:
manchas foliares de diferentes formas, colores, tamaño, y sitios de desarrollo
en la hoja, presencia o no de halo clorótico alrededor de las manchas foliares,
manchas foliares en los espacios intervenales o al lado de las nervaduras,
manchado oscuro de la corteza, oscurecimiento, muerte de los haces vasculares
en dirección descendente, secamiento de la ramilla en forma descendente,
presencia de zonas con corteza oscura (ennegrecidas) y secamiento del racimo
floral. Para ello se colectaron muestras de hojas, ramas, flores y segmentos de
tallos con síntomas asociados al problema sanitario, seguido de una fase de
aislamiento y caracterización morfológica de los microrganismos y pruebas de
patogenicidad (postulados de Koch). De acuerdo con los resultados, se aislaron
los hongos Colletotrichum gloesporioides, Pestalotia heterocornis y
Lasidioploidía theobromae, con una prevalencia del 60%, 30% y 3%,
respectivamente; afectando hojas, ramas, flores y frutos e identificados
molecularmente mediante los genes ITS (ADN espaciador).
Palabras
claves: Colletotrichum
gloesporioides, hongos, Lasidioploidía theobromae, marañón, muerte descendente, Pestalotia heterocornis.
MICROORGANISMS
ASSOCIATED WITH CASHEW DIEBACK
ABSTRACT
In Panama,
the cashew (Anacardium occidentale
L.) grows mainly in the lowlands of the Pacific Ocean slope. Data from the
Statistics Institute (Government of Panama) indicate the existence of 963 253,
distributed over 406 commercial hectares and backyards. The objective of this
research was to identify the main microbial agents associated with the
so-called "cashew dieback", with symptoms like: leaf spots of
different shapes, colors, size, and sites of development on the leaf, presence
or absence of a chlorotic halo around the leaf spots, leaf spots in the
interveinal spaces or next to the veins, dark staining of the bark, darkening,
death of the vascular bundles in a downward direction, drying of the twig in a
downward direction, presence of areas with dark bark (blackened) and drying of
the floral cluster. For this, samples of leaves, branches, flowers and stem
segments with symptoms associated with the health problem were collected,
followed by a phase of isolation and morphological characterization of the
microorganisms and pathogenicity tests (Koch's postulates). According to the
results, fungi Colletotrichum
gloesporioides, Pestalotia
heterocornis and Lasidioploidía
theobromae, with a prevalence of 60%, 30% and 3%, respectively; affecting
leaves, branches, flowers and fruits and molecularly identifying them through
ITS genes (spacer DNA).
Keywords: Colletotrichum
gloesporioides, fungi, Lasidioploidia theobromae, cashew,
dieback, Pestalotia heterocornis.
INTRODUCCIÓN
En la República de Panamá, el
marañón (Anacardium occidentale L.)
se desarrolla principalmente en las tierras bajas del pacífico. Se suelen
utilizar materiales genéticos criollos, sin manejo de copa, sanitario y
nutrición, sólo se realiza la cosecha del pseudofruto para elaboración de jugos
y dulces y la recolecta del fruto (nuez) para el consumo de su almendra (Ministerio
de Desarrollo Agropecuario [MIDA],
2017).
El marañón se creía una especie
con muy pocos problemas sanitarios, con excepción de tipos endémicos como la
antracnosis en la etapa de floración. Aproximadamente, desde hace unos cuatro
años en la vertiente del Pacífico de Panamá, se observa en los árboles de
marañón dispersos a orilla de caminos, cercas y en huertos caseros, la
presencia de un creciente problema fitosanitario caracterizado por el manchado de las hojas, flores, ramas, en algunos casos
debilitando a la planta al limitar su área fotosintética con el manchado
del haz, causando necrosis de la lámina y abscisión foliar (MIDA, 2017).
En otros casos, es visible la
movilización de la enfermedad en forma descendente hacia ramas y tallo,
ocasionando serios daños en el desarrollo vegetativo y productivo, y en
ocasiones, causando el colapso de la planta (Pérez Miranda et al., 2005).
Es determinante identificar el o
los agentes patogénicos causantes de este problema sanitario de muerte
descendente; ya que a nivel de producción ha provocado una reducción anual en
la recolección de nueces, con la consecuente falta de materia prima para la
industria local dirigida al procesamiento de la nuez. Lo que constituye en una
seria amenaza para la sostenibilidad del cultivo a nivel de los sistemas de
huerto familiar y de parcela comercial.
En otros países se ha reportado
este fenómeno involucrando a diversos agentes causales:
En Cuba se observaron sobre las
hojas de Anacardium occidentale L.,
manchas necróticas aisladas marrón claro en el borde de la hoja que
posteriormente, formaron lesiones necróticas en diferentes secciones de la
superficie foliar, así como lesiones en las inflorescencias, coincidiendo con
las reportadas para Phomopsis anacardii, siendo la primera descripción
de la especie realizada en el país, como agente causal de necrosis en los
brotes, hojas y quemaduras de las inflorescencias de Anacardium occidentale L. (Pérez Miranda et al., 2005).
En León (Nicaragua) se identificaron
y describieron los síntomas de Pestalotia sp, y Cephaleuros sp, que resultaron ser, los principales agentes causales de daño
foliar en marañón (Jiménez y Gómez, 2010).
En Brasil, Pseudoidium
anacardii ha surgido como una seria amenaza para el cultivo de marañón,
atribuyéndole una considerable disminución de la producción (Pinto et al.,
2016). Lasiodiploidia theobromae,
es otro patógeno reportado en Brasil asociado a daños en el marañón,
presentando como síntoma una gomosis en la planta (Munis et al., 2012).
Este estudio se desarrolló con el
objetivo de identificar los principales
agentes patogénicos asociados a problemas sanitarios emergentes en Marañón (Anacardium
occidentale L.). en
fincas de producción comercial, huertos de traspatio y árboles localizados a
orillas de carreteras ubicadas en la provincia de Coclé (Panamá).
MATERIALES
Y MÉTODOS
Se realizaron muestreos aleatorios
en fincas de producción comercial, huertos de traspatio y árboles localizados a
orillas de carreteras ubicadas en la provincia de Coclé (Panamá), que
presentaron hojas, ramas, flores y segmentos de tallos síntomas asociados al
problema sanitario.
Test de patogenicidad:
Se utilizó como herramienta los postulados de Koch. Se realizó la
inoculación de plantas sanas con cada uno de los aislados obtenidos a partir de
lesiones, para inducir la replicación de los síntomas observados en plantas
afectadas, dentro de un ambiente semi controlado en casa de vegetación con
techo y paredes de malla anti-insectos creando un aislamiento físico parcial.
Los marañones se sembraron en
recipientes (potes) de plástico que contenían suelo esterilizado y se colocaron
bajo un invernadero con un fotoperiodo promedio de 12 h con riego suplementario
cada 2 días. Después de 28 días, las plántulas se inocularon con una suspensión
de conidias cuando alcanzaron la etapa de 6-8 hojas. El inóculo se preparó a
partir de cultivos de 25 días añadiendo a las placas Petri 10 ml de agua
destilada estéril. Los conidios se recolectaron con micropipeta y se contaron
en una cámara Neubauer. La concentración de conidios se ajustó a 1,0X106
conidios por ml y se le añadió un ml de una solución de agar y glucosa (1%). La
suspensión de conidios (12,5 ml por planta) se aplicó en la superficie inferior
de las hojas con un frasco atomizador. Las plantas de control se rociaron con
agar y solución de glucosa. Antes y después de la inoculación, las plantas
fueron cubiertas con bolsas de plástico para mantener una humedad superior al
90%. Se utilizaron aislamientos (entre 5 y 7) de C. gloesporioides, P.
heterocornis y L. theobromae. Se utilizaron cinco plantas por aislamiento.
Análisis estadístico: El diseño
experimental fue completamente al azar con tres repeticiones para cada
tratamiento. Los datos recopilados se analizaron mediante análisis de varianza
(ANOVA 1) de una vía, P≤0,05 y test de rangos múltiples de Tukey.
Caracterización de morfotipos (Microcultivo)
Se utilizó el método de
microcultivo que es el más preciso, ya que permite observar las estructuras in
situ (Arenas, 1993).
Los hongos que presentaron
actividad fitopatológica fueron cortados con una hoja de bisturí de la placa,
con medio de agar papa dextrosa (PDA), en cuadrados de agar de 0,5 cm. Con la
hoja de bisturí se colocó un cuadrado en el portaobjetos. Luego se sembró el
hongo con la espátula en las cuatro esquinas y en el centro del bloque de agar,
colocando el cubreobjeto sobre el bloque de agar PDA. Se generó una cámara
húmeda dentro del plato Petri con el objetivo de favorecer el crecimiento del
hongo y se incubó a 28° C. Después de siete días se desprendió el portaobjeto,
se le colocó una gota de azul de lactofenol y se observó al microscopio (40X y
100X) buscando estructuras reproductivas (Casa, 1989; Arenas, 1993).
Para su identificación molecular
se amplificaron por PCR convencional los genes ribosomales asociados al
espaciador transcrito interno conocido en inglés como internal transcribed spacer (its) y se secuenciaron
con el fin de determinar la especie de hongos (Figura 1).
RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Los
aislamientos fúngicos asociados a las lesiones encontradas en las hojas,
inflorescencias, ramas y frutos del marañón se asociaron en su mayoría a las
especies C. gloeosporioides (Figura
2), P. heterocornis (Figura 3), L. theobromae (Figura 4).
La especie C. gloeosporioides se aisló de hojas, inflorescencias
(Figura 5), nueces y pseudofrutos (Figura 6), mientras que P. heterocornis
se aisló de ramas y hojas infectadas (clorosis), y L. theobromae se
encontró en tejido vascular de ramas.
En esta investigación se observó que todas las partes del árbol de
marañón son susceptibles al ataque de patógenos. Particularmente, el genéro Colletotrichum
es el patógeno con mayor grado de incidencia (60%) y que afecta a muchas partes
de la planta. Un aspecto importante para resaltar es que las especies de Colletotrichum
se consideran uno de los patógenos de plantas más importantes desde el punto de
vista económico que afectan a una amplia gama de especies de plantas como el
banano, el jengibre, la soja y mango (Photita et al., 2005). Las especies de Pestalotia (incidencia
30%) se aislaron fundamentalmente de hojas y ramas, mientras que las especies
de Lasiodiplodia principalmente se hallaron en ramas (Figura 7). Las
lesiones necróticas observadas pseudofrutos y nueces fueron atribuibles a C.
gloeosporiodes; este hongo también se aisló de áreas necróticas de color
rojizo en hojas de árboles adultos y plantones de marañón. La desecación de las
inflorescencias también se atribuyó a C. gloeosporioides. En este
sentido, C. gloeosporioides y P. heterocornis se aislaron
principalmente de hojas que presentaban síntomas similares. Sin embargo, las
manchas negras necróticas en hojas provocadas por P. heterocornis fueron
más pequeñas que las causadas por C. gloeosporioides. Se logró aislar un
complejo formado por L. theobromae (incidencia 3%) en asociación con P.
heterocornis que provocaron lesiones ennegrecidas por fisuras en ramas.
Nuestros resultados coinciden con los obtenidos por Freire et al. (2002), y López y Lucas
(2010), para la prevalencia de estos géneros fúngicos.
En cuanto los rasgos morfológicos (morfotipos), los cuales incluyen
características de los conidios tales como longitud, ancho, forma y tamaño del
micelio se observó lo siguiente (medias): para C. gloesporioides las
conidias fueron cilíndricas presentando un largo de 14 µm; ancho de 4,69 µm;
tamaño de micelio 76,1 mm. P. heterocornis presentó conidias
elipsoidales de 16 µm de largo, 6 µm de ancho y un micelio de 82,2 mm. Por otra
parte, L. theobromae. presentó conidias cilíndricas de 21 µm de largo,
11,5 µm de ancho y un micelio de 84,2 mm (Figura 8).
En
relación con los ensayos de patogenicidad, luego de 21 días, los plantones de
marañón inoculados con 1,0 X 106 esporas (conidias) de suspensión de
aislamientos fúngicos seleccionados, desarrollaron pequeñas manchas negruzcas
en las hojas. Posteriormente, (2-3 meses después), se observó un área
amarillenta alrededor de la mancha necrótica negra. Todos los aislamientos fueron patógenos para
los plantones de marañón. En la condición control, no se desarrolló ningún
síntoma durante este ensayo. El patógeno se volvió a aislar consistentemente de
hojas de marañón infectadas en agar papa dextrosa, cumpliendo con los
postulados de Koch.
La
identificación molecular de los hongos se realizó mediante la extracción de ADN
según Chen et al., 2010
con modificaciones menores. Seguidamente se amplificó por reacción en cadena de
la polimerasa el gen ITS (espacio
transcrito interno de DNA ribosomal), con un tamaño de aproximadamente de 550 a
600 pares de bases (bp). La secuenciación se realizó mediante next generation
sequence (NGS) de Ilumina®. La naturaleza de multicopia del rDNA permite que la
región ITS sea fácil de amplificar con pequeñas cantidades de DNA y obtener un
producto cuya variabilidad típicamente refleja sinapomorfías a nivel de
especie. Esta región muestra un alto grado de polimorfismo entre especies, pero
se cree que está altamente conservada dentro de las especies, por lo tanto, es
un valioso marcador genético para la identificación de especies (Karen et al., 1997).
CONCLUSIONES
· Se
identificaron como hongos asociados a la muerte descendente del marañón los
patógenos Colletotrichum gloesporioides, Pestalotia heterocornis y Lasidioploidía
theobromae, con una prevalencia del 60%, 30% y 3%, respectivamente;
afectando hojas, ramas, flores y frutos en los árboles de marañón.
REFERENCIAS
Arenas,
R. (1993). Micología Médica ilustrada. Segunda edición. MgGraw Hill. México
D.F. 352 pp.
Casa,
G. (1989). Micología General. Edición I. Caracas, Venezuela.448 pp.
Chen, H., Rangasamy, M., Tan, S., Wang, H., y
Siegfried, B. (2010). Evaluation of five methods for total DNA extraction from
western corn rootworm beetles. PLoS ONE, 5 (8), e11963. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011963
Freire,
F. C. O., Cardoso, J. E., dos Santos, A. A., y Viana, F. M. P. (2002). Diseases of cashew nut
plants (Anacardium occidentale L.) in
Brazil. Crop Protect., 21(6),
489-494. https://doi.org/10.1016/S0261-2194(01)00138-7
Karen,
O., Högberg, N., Dahlberg, A., Jonsson, L., y Nylund, J. E. (1997). Inter- and
intraspecific variation in the ITS region od rDNA of ectomycorrhizal fungi in Fennoscandia
as detected by endonuclease analysis. New
Phytol. 136(2), 313- 325. https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1469-8137.1997.00742.x
Jiménez,
M., y Gómez, M. (2012). Identificación
y descripción de síntomas de los principales patógenos asociados al cultivo de
marañón (Anacardium occidentale L.)
orgánico y convencional, en León, Nicaragua; Revista Científica La Calera, 12(18), 01-08. https://repositorio.una.edu.ni/2378/
López,
A. y Lucas, J.
(2010). Colletotrichum isolates related to anthracnose of cashew trees in
Brazil: Morphological and molecular description using LSU rDNA sequences. Braz. Arch. Biol. Technol., 53(4)
741-752. https://www.scielo.br/j/babt/a/VzCGsL6GYbSJtCvKHnn5dwF/abstract/?lang=en
Ministerio
de Desarrollo Agropecuario. (2017). Dirección Nacional de Agricultura. Panamá.
Pérez
Miranda, M., Pérez
Vicente, L. F., y Pueyo Figueroa, M. (2005). Manchas de las hojas de marañón (Anacardium
occidentale L.) provocadas
por Phomopsis anacardii early &
punith, Fitosanidad, 9(2), 21-24. https://www.redalyc.org/pdf/2091/209116161003.pdf
Muniz,
C., Freire, F., Viana, F., Cardozo, J., Cooke, P., Wood, D., y Guedes, M.
(2011). Colonization of cashew plants by Lasiodiplodia theobromae: microscopical features. Microm, 42(5), 419-428. https://doi.org/10.1016/j.micron.2010.12.003
Photita, W., Taylor, P., Ford, R., Hyde, K., y Lumyong, S. (2005). Morphological
and molecular characterization of Colletotrichum species from herbaceous plants
in Thailand. Fungal Diversity, 18,
117-133. https://www.scirp.org/(S(lz5mqp453ed%20snp55rrgjct55))/reference/referencespapers.aspx?referenceid=1664369
Pinto, O. R. O., Muniz, C. R., Cardoso, J. E., Oliveira, F. S. A., y
Lima, J. S. (2016). Morphological analyses of Pseudoidium anacardii infecting brazilian cashew plants. Summa Phytopathologica, 42(3),
257-260. https://doi.org/10.1590/0100-5405/2101